Penuntun Praktikum Ilmu Penyakit Bakterial dan Jamur

Penuntun Praktikum Ilmu Penyakit Bakterial dan Jamur

Laboratorium Mikrobiologi

Fakultas Kedokteran Hewan

Universitas Udayana

Denpasar

2001

Tata Tertib Praktikum Mikrobiologi

Agar kegiatan praktikum berjalan dengan tertib, aman, dan lancar serta terhindar dari bahaya yang mungkin timbul, maka sebelum melakukan praktikum harus menaati ketentuan-ketentuan sebagai berikut:

1. Jangan membawa barang-barang yang tidak digunakan dalam praktikum dan tempatkan pada tempat yang telah disediakan.
2. Gunakan pakaian kerja (jas lab) yang bersih, untuk menghindari kontaminasi, infeksi dan sebagainya.
3. Sebelum diadakan praktikum, maka peserta praktikum sudah siap dengan topik yang akan dipraktikkan, sehingga praktikum dapat berjalan dengan lancar.
4. Tidak boleh makan dan minum didalam laboratorium kecuali berkaitan dengan praktikum seperti uji organoleptik.
5. Pakailah alat-alat lab secara baik dan benar, kalau belum tahu cara pengoperasiannya dapat ditanyakan kepada petugas.
6. Semua benda atau bahan-bahan yang sudah tidak dipakai lagi seperti korek api, kertas dan lain sebagainya ditempatkan pada suatu tempat yang telah disediakan.
7. Dilarang membuang biakan hidup ke bak pencuci atau sembarang tempat, tetapi buanglah pada tempat yang telah disediakan.
8. Setelah pekerjaan selesai, bersihkan semua alat0alat yang telah dipakai dan taruh pada tempat yang telah disediakan.
9. Sebelum meninggalkan lab, matikanlampu, kompor dan kran air.
10. Buat catatan-catatan tentang kegiatan praktikum serta hasil yang diperoleh.

I. Isolasi dan Identifikasi Kuman

1. Alat-alat yang diperlukan :

Cawan petri, tabung reaksi, magnetik stirer, timbangan, erlenmeyer, gelas beker, sendok, ose (lup), kapas, korek api, api bunsen, inkubator, autoclave, gunting, scalpel.

2. Bahan-bahan yang diperlukan :

Tinja, organ atau darah dibawa oleh peserta praktikum/group. Aquase steril, alkohol, spritus, NA, MCA, TSIA, Simmon Citrate, SIM, MRVP.

Di alam terdapat beraneka macam mikroba hidup secara berdampingan tanpa kita sadari. Mikroba tersebut dapat berupa bakteri, jamur, parasit maupun virus. Untuk mengetahui jenis-jenis kuman yang terdapat dialam maupun yang terdapat pada hewan yang sakit maka perlu dilakukan isolasi dan identifikasi kuman.

Isolasi dalam pengertian ini adalah transfer atau usaha memindahkan mikroorganisme dari tempat hidupnya ke media buatan yang sesuai. Juga dapat dikatakan sebagai suatu usaha untuk memperioleh isolat atau koloni kuman dari suatu media tertentu yang sesuai atau dari suatu bahan/spesimen. Sedangkan identifikasi merupakan kelanjutan dari proses isolasi yang bertujuan untuk mengetahui sifat-sifat khas dari suatu kuman dengan demikian akan diperoleh nama bakteri yang bersangkutan. Pada identifikasi kuman akan menyangkut uji biokimia, uji gula-gula maupun uji serologis.

Karena beraneka ragam bakteri yang ada didalam spesimen, maka pada isolasi pertama (biakan pertama) akan tumbuh berjenis-jenis kuman. Dengan demikian akan menulitkan baik dalam identifikasi koloni maupun dalam pengambilan koloni untuk uji selanjutnya. Untuk mengatasi kejadian ini maka koloni-koloni tersebut perlu dibiakkan ulang (sub-culture) pada media biakan yang berbeda.

Ada beberapa hal yang harus dipahami sebelum melakukan pemupukan kuman antara lain :

a. Spesimen dan cara pengambilan spesimen.

b. Seleksi media yang sesuai dengan kebutuhan kuman

c. Kondisi inkubasi

Spesimen yang dipakai dalam pemeriksaan kuman dapat berupa tinja, darah, urin, jaringan/organ, pus, cairan udem dan lain sebagainya. Spesimen yang akan diambil harus dikaitkan dengan proses penyakit pada hewan, tanda-tanda klinis yang terlihat kerusakan-kerusakan pada organ dalam dan sebgainya. Dengan demikian sebelum mengambil spesimen praktikan diharaokan telah mengetahui terlebih dahulu kriteria penyakit infeksi.

Cara pengambilan spesimen harus dilaksanakan secara aseptis artinya bebas dari kontaminan yang tidak diharapkan, alat-alat dan bahan-bahan yang digunakan harus juga steril. Disamping itu perlu dipertahankan agar kuman dalam spesimen tersebut tetap hidup dengan jalan menempatkan pada suhu rendah atau pada spesimen diberikan media transport.

Pemakainan media biakan harus disesuaikan dengan jenis kuman yang akan diperiksa, karena masing-masing kuman kadang-kadang memerlukan zat-zat tertentu untuk pertumbuhannya. Misalnya kuman streptococcus memerlukan darah/serum kuda, keuman Haemophilus memerlukan faktor z dan faktor v untuk memacu pertumbuhannya dan untuk mengisolasi jamur dipakai media biakan Sabouraud agar.

Setelah dipupuk pada media biakkan maka perlu dieramkan (inkubasi) pada inkubator. Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam inkubasi kuman adalah :

1. Oksigen. Kebutuhan akan oksigen berbeda-beda. Ada kuman yang memerlukan oksigen untuk pertumbuhannya (aerob) ada yang tidak memerlukan oksigen (anaerob), memerlukan sedikit oksigen dalam jumlah yang terbatas (mikroaerob) dan ada oksigen akan tumbuh tidak ada oksigen juga tumbuh (fakultatif anaerob).
2. Temperatur. Secara umum bakteri yang patogen akan tumbuh pda suhu 37°C. Namun ada juga bakteri tertentu yang pertumbuhannya memerlukan suhu optimum berkisar 22-25°C seperti jamur, 29-30°C untuk leptospira.
3. Waktu. Pada umumnya kuman memerlukan waktu inkubasi selama 24 jam, tetapi beberapa kuman seperti Brucella, Leptospira, Campylobacter, Mycobacterium dan beberapa jenis jamur perlu waktu inkubasi lebih lama bahkan dapat berminggu-minggu baru tumbuh.

Setelah kuman-kuman tersebut tumbuh, pilihlah salah satu koloni terpisah untuk mendapatkan biakkan murni, biakkan murni tersebut selanjutnya digunakan untuk penyelidikan sifat-sifat kuman. Sifat-sifat kuman yang digunakan dalam identifikasi adalah :

1. Sifat-sifat morfologik dan hasil pewarnaan

Dalam bagian ini ditentukan bentuk sel kuman (kokus, basil atau spiral), susunan sel kuman, ukurannya, ada tidaknya spora, bekapsul, bersifat Gram positif atau negatif dan sebagainya.

2. Sifat-sifat biakkan

Dari pertumbuhan kuman pada media cair dan padat diperoleh keterangan-keterangan tambahan untuk identifikasi kuman. Pada perbenihan cair dapat dilihat : kekeruhan, endapan, bau. Pada perbenihan padat dapat dilihat : bentuk koloni, warnanya, elevasi, bau, konsistensi, tepi dan diameter koloni. Pada agar miring kuman dapat tumbuh terbatas pada daerah usapan, menyebar dan sebagainya. Pada agar semi solid dapat dilihat pergerakan kuman, pencairan perbenihan seperti pada gelatin.

3. Sifat-sifat fisiologi dan biokimia

Pada bagian ini meliputi antara lain : suhu yang terbaik untuk pertumbuhan, sifat pertumbuhannya aerob/anaerob, kemampuan kuman untuk membentuk H­­₂­S, asetil metil karbinol, indol, juga fermentasi karbohidrat dan lain sebagainya.

4. Patogenesis kuman

Patogenitas kuman dapat diketahui dengan melakukan penyuntikan kuman tersebut pada binatang percobaan, misalnya marmut, mencit, kelinci dan sebagainya.

5. Tes serologi

Kuman yang disuntikkan pada binatang percobaan akan merangsang binatang tersebut untuk membuat zat anti di dalam tubuhnya. Tes aglutinasi antara kuman dengan serum antinya diatas objek gelas disebut slide agglutination test atau tes aglutinasi secara cepat. Tes hasilnya positif ditandai dengan adanya aglutinat seperti pasir putih halus terbentuk dalam waktu relatif singkat (± 2 menit ). Disamping tes ini juga banyak tes serologik lainnya.

Secara garis besar tahapan-tahapan yang dilakukan dalam isolasi dan identifikasi bakteri dan spesimen klinik :

(Sumber : Carter, G.R., 1984)

PETUNUJUK CARA ISOLASI DAN IDENTIFIKASI

A. Isolasi Kuman

Tugas praktikan adalah membawa spesimen berupa organ, rektal swab (tinja), pus, cairan udema dan lain sebgainya. Untuk mempertahankan kuman tetap hidup dan tidak ada bakteri kontaminan dalam spesimen maka perlu beberapa perlakuan khusus.

Berikut ini adalah salah satu cara pengambilan spesimen yang baik :

Cara pengambilan organ adalah sebgai berikut :

- Persiapkan terlebih dahulu pinset dan gunting steril.

- Organ yang akan diambil dipegang dengan pinset dan dipotong dengan gunting tersebut.

- Masukkan organ tersebut kedalam kantong plastik steril lalu ditutup rapat-rapat. Harus diingat organ tersebut tidak boleh menyentuh bahan atau organ lain atau digabungkan dengan bahan/organ lain dalam satu wadah,kantong plastik tersebut dimasukkan dalam termos es atau disimpan pada suhu dingin (dalam kulkas ± 4°C, selanjutnya segera dibawa ke laboratorium untuk diperiksa, bahan yang diperiksa harus dilengkapi dengan label atau catatan, misalnya sejarah singkat penyakit, hospes penderita, gejala klinis, nama organ dan sebagainya.

- Bahan terseut ditaruh dalam cawan petri steril, untuk mencegah kontaminan pada permukaan spesimen tersebut, maka permukaan bahan tersebut bisa diolesi dengan yodium tinctur atau permukaannya dibakar sesaat diatas nyala api (flame bunsen).

Cara melakukan pemupukan :

- Dengan menggunakan gunting steril, bahan tersebut dilukai atau dikoyak dengan ose steril, lalu cairannya diambil dengan ose steril kemudian diusapkan pada permukaan media biakkan. Untuk spesimen yang berasal daru tinja, pus atau cairan udema diambil dengan ose yang steril dan langsung diusapkan pada permukaan media. Pemupukan dilakukan pada media umum (nutrient agar) dan media selektif misalnya MacConkey atau Eosin Methylen Blue Agar dengan menggunakan salah satu metode pemupukan misalnya multiple line. Sebelum bahan tersebut dipupuk dalam media plate agar tersebut maka yang harus diperhatikan adalah media yang dipakai harus steril, permukaan media harus sudah kering. Setelah melakukan pemupukan media tersebut diinkubasikan dalam suhu 37°C selama 24 jam. Catat dan identifikasikan koloni yang tumbuh pada media tersebut, meliputi bentuk, warna, tepian, elevasi, konsistensi, bau dan diameter koloni.

B. IDENTIFIKASI KUMAN

Identifikasi kuman merupakan kelanjutan dari isolasi kuman pada berbagai media biakkan. Dalam identifikasi ini akan meliputi uji biokimia kuman, uji gula-gula, uji serologis dan uji biologis, karena keterbatasan sarana yang tersedia maka dalam praktikum ini hanya dilakukan uji biokimia pda berbagai media dan uji serologis untuk kuman salmonella.

1. Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

Media ini termasuk media padat dan bentuknyya setengah miring.

Formula dari media ini dalam gram/ml (oxoid) :

Lab-lemco Powder 3,0

Yeast ektrak 3,0

Peptone 20,0

Sodium Chloride 5,0

Laktose 10,0

Sukrose 10,0

Glukose (Dekstrose) 1,0

Feric Citrat 0,3

Sodium Thiosulphat 0,3

Phenol red qs

Agar 12,0

Cara : Ambil koloni kuman dengan ese runcing steril (needle) dari hasil isolasi pada media selektif yang telah anda lakukan. Pupuk dengan cara menusukkan pada bagian tegak dari medium lalu digoreskan pada bagian miring medium, selanjutnya medium tersebut diinkubasikan pada 37°C selama 24 jam.

Catat sifat kuman pada media tersebut. Dengan melihat adanya acid slant, acid butt yang ditandai dengan perubahan warna media pada bagian tegak/miring. Adanya gas dapat diamati dengan adanya gelembung gas pada media, keretakan pada media atau media akan terangkat keujung tabung dan produksi gas H₂S akan terlihat jika media berubah menjadi hitam.

2. Sulfide Indol Motillity (SIM) = Agar Semi Solid

Media ini termasuk media semisolid (setengah padat). Kegunaan media ini adalah untuk mengetahui sifat kuman dalam memproduksi H₂S, Indol dan pergerakan kuman (motilitas).

Formulanya (Oxoid) dalam gram/ml adalah :

Tryptopan 20,0

Pepton 6,1

Ferrous ammonium sulphat 0,2

Sodium thiosulphate 0,2

Agar No.1 3,5

Cara : Ambil koloni kuman dengan ose runcing steril (needle) dari hasil isolasi yang telah anda lakkan, pupuk dengan cara menusukkan secara tegak lurus pda medium, lalu diinkubasikan pada suhu 37°C selama 24jam

Catat hasilnya meliputi: produksi H₂S ditandai dengan media berwarna hitam, produksi indol dapat dilihat setelah ditetesi dengan reagen Erlich/Kovac’s sebanyak 3-5 tetes kedalam media, bila indol positif terbentuk cincin merah pada permukaan medium, kuman motil akan terlihat kekaburan media ditempat tusukan.

3. MRVP Medium (Methyl Red Voges Proskauer Medium)

Formulanya (Oxoid) dalam gram/ml adalah:

Pepton P 5.0

Dekstrose 0.5

Phospat Buffer 5.0

Cara: Pupuk koloni yang dicurigai tadi kedalam medium MRVP dengan ose steril yang telah dibebani kuman lalu dicelupkan kedalam medium tersebut, selanjutnya medium tersebut diinkubasikan pada suhu 37°C selama 24 jam. Selanjutnya media tersebut dibagi kedalam dua tabung yang steril. Tabung pertama ditetesi dengan reagen MR dan tabung kedua ditetesi dengan reagen VP. Catat sifat pertumbuhan kuman meliputi produksi asam tunggal atau campuran setelah ditetesi dengan reagen MR dan produksi asam meril korinol setelah ditetesi dengan reagen VP. Hasil yang positif ditandai dengan adaynya warna merah pada medium. (Cincin warna merah).

4. Simmon Citrat Agar.

Media merupakan media padat dan bentuknya sangat miring.

Formulanya (oxoid) dalam gram/ml adaah:

Magnesium Sulphate 6.2

Ammonium Dihydrogen Phospate 6.2

Sodium Ammonium Phospate 0.8

Socium Citrate Tribasic 2.0

Sodium Chlorida 5.0

Brom Thymol Blue 0.08

Agar 15.0

Cara: Dengan ose steril ambil koloni kuman yang dicurigai tersebut lalu usapkan pada permukaan medium mulai dari pangkal sampai keujung yang lain. Inkubasikan medium tersebut pada suhu 37°C selama 24 jam. Catat sifat pertumbuhan kuman apakah kuman mampu memanfaatkan sitrat sebagai sumber karbonnya atau tidak. Pertumbuhan kuman ditandai dengan perubahan warna media dari hijau menjadi biru.

5. Tes Serologis

Koloni yang tumbuh dicurigai kumnan Salmonella akan dilanjutkan dengan tes serologis secara cepat.

Cara:Ambil tabung reaksi yang telah berisi fenol salin, kemudian ambil koloni kuman yang dicurigai Salmonella dan masukkan kedalam tabung reaksi tadi. Lalu dilarutkan dengan jalan digoyang-goyangkan. Kemudian ambil objek gelas yang bersih lalu tetesi dengan serum Salmonella sebanyak 1 tetes. Selanjutnya ambil sebanyak satu loop penuh suspensi tadi dan letakkan pada tetesan serum Salmonella tadi, sambil digoyang-goyangkan. Apabila positif akan terbentuk aglutinat seperti pasir berwarna putih dalam jangka waktu sekitar 1-2 menit.

II.

PENENTUAN KEPEKAAN KUMAN TERHADAP ANTIBIOTIKA

Keberhasilan pengobatan terhadap infeksi bakterial, sangat ditentukan oleh ketepatan memilih obat, ketepatan dosis, dan tepat waktu. Pada praktikum kali ini akan diperkenalkan bagaimana cara memilih obat antibiotika secara tepat, yakni menguji antibiotika tersebut secara invitro terlebih dahulu.

Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah kuman yang telah diisolasi (sebagai penyebab infeksi)sensitif, intermedier, atau resisten terhadap antibiotika. Untuk keperluan tersebut diperlukan beberapa jenis antibiotika, kuman yang akan diuji dan media pertumbuhan.

Antibiotika yang dapat digunakan untuk mengobati penyakit infeksi tersebut adalah antibiotika yang pada uji invitro menunjukkan kuman sensitif atau intermedier terhadap antibiotika tersebut, sedang bila menunjukkan resisten tidak dapat digunakan. Disamping itu aplikasi pada penderita perlu dipertimbangkan apakah hewan yang diobati tidal alergi terhadap antibiotika yang akan diberikan.

Penentuan kepekaan kuman terhadap suatu antibiotika adalah penentuan kadar obat terkecil yang dapat menghambat pertumbuhan kuman secara invitro. Sekarang ini telah banyak cara yang ditempuh pada uji kepekaan kuman. Masing-masing cara tersebut mempunyai kelebihan dan kekurangan sendiri-sendiri. Dalam hal ini WHO telah menetapkan suatu standar yang memungkinkan suatu laboratorium meninjau cara-cara mereka, sehingga hasil pemeriksaan yang dilaporkan akan mempunyai satu dasar yang sama.

Dibawah ini diuraikan beberapa cara penentuan kepekaan kuman terhadap antibiotika yang digunakan.

a. Cara Difusi Cakram Menurut Metode Kirby-Bauer.

Cara ini paling banyak dipakai untuk menentukan kepekaan kuman terhadap berbagai macam antibiotika. Disini dipergunakan cakram kertas saring yang mengandung suatu obat dengan konsentrasi tertentu yang ditempelkan pada lempeng agar yang telah ditanami kuman. Hambatan (killing zone) akan tampak sebagai daerah yang tidak memperlihatkan pertumbuhan kuman disekitar cakram. Lebar daerah hambatan ini tergantung ada daya serap obat kedalam agar dan kepekaan kuman terhadap obat tersebut.

Cara kerja:

1. Inokulasikan 3-10 koloni kuman murni kedalam 4 ml perbenihan cair (Trypticase Soy Broth, Tryptose Phospate Broth, Bouillon).

2. Inkubasikna perbenihan tersebut pada suhu 37°C elama 2-5 jam.

3. Ambil biakkan tersebut dan cocokkan kekeruhan biakkan tersebut dengan standar kekeruhan Max Farland (setara dengan kandungan kuman 10⁶ sel per ml).

4. Apabila telah sesuai biakkan pupuk tersebut dengan menggunakan swab steril keseluruh permukaan media Mueller-Hinton agar plate secara merata, kemudian diamkan sampai 30 menit agar biakkan meresap.

5. ambil kertas cakram (paper disk)yang telah diketahui mengandung antibiotika dengan pinset yang steril dan tempelkan pada permukaan media Mueller-Hinton tersebut. Jarak tempel antara stu paper disk dengan paper disk yang lain minimal 2 cm dan 2cm dari tepi plate. Pada lempeng petri yang mempunyai garis tengah 150 mm dapat dipakai 9 cakram dalam tiap lempeng.

6. Inkubasikan perbenihan tadi pada suhu 37°C selama 18-24 jam.

7. Amati dan ukur diameter killing zone yang terbentuk pada tiap cakram.

8. Cocokkan killing zone dalam mm yang terbentuk dengan standar, setelah itu baru bisa disimpulkan apakah kuman tersebut peka, kurang peka atau resisten terhadap obat yang diperiksa. Misalnya standar killing zone sebagai contoh:

Obat	Konsentrasi (µg)	Resistensi (mm)	Kurang Peka (mm)	Peka (mm)
Tetrasiklin Eritromisin Kloramfenikol Streptomisin	30 15 30 10	14<> 12< 11<	15-18 14-17 13-17 12-14	18> 18> 18> 15>

Hal-hal yang perlu diperhatikan pada metode difusi cakram :

1. Dianjurkan untuk menggunakan biakkan kontrol sebagai pembanding kuman yang diperiksa terhadap obat yang dipakai.
2. Bila menggunakan terapi kombinasi janganlah memakai cakram yang ditumpuk.
3. Jangan memakai paper disk yang kadaluarsa.
4. Harus meperhatikan [rosedur penyimpanan obat agar tetap stabil.
5. Hasil yang meragukan sebaiknya dianggap lebih resisten, bila perlu diulang lagi dengan cara yang sama.
6. Besar daerah hambatan harus disesuaikan dengan standar internasional.
7. Untuk kuman Staphilococcus dianggap peka terhadap penicillin apabila daerah hambatan yang terbentuk lebih dari 20 mm.
8. Apabila terjadi pertumbuhan koloni kecil-kecil pada daerah bening disekitar cakram maka dinyatakan resisten.

b. Cara Penipisan Lempeng Agar

Prinsip dari cara ini adalah penghambatan pertumbuhan kuman pada permukaan agar terhadap obat yang dicampurkan kedalam perbenihan. Biasanya disediakan satu seri lempeng agar dengan penipisan yang berbeda-beda. Dalam hal ini prinsipnya adalah penentuan konsentrasi terkecil dari antibiotika yang mampu menghambat pertumbuhan kuman (MIC=Minimal Inhibitory Concentration) secara in-vitro.

Prinsip kerjanya meliputi: Larutan antibiotika dibuat secara aseptik dengan melakukan pengenceran sehingga diperoleh suatu larutan yang mengandung 100µ/ml (larutan stock) dari larutan ini dibuat satu seri penipisan sesuai yang dikehendaki. Media biakkan yang sering dipakai dala uji kepekaan kuman adalah Mueller-Hinton Agar, Trypticase Soy Agar, Diagnostic Sensitivity Agar.

Lempeng agar dibuat dengan cara mencairkan 19ml agar tuangan yang telah disediakan, kemudian sterilisasi lalu didinginkan sampai 15-10°C, kemudian tambahkan 2 ml obat yang telah ditipiskan, campurkan dengan cara memutar-mutar cawan petri kekanan-kekiri 3-5 kali. Selanjutnya lempeng agar dibiarkan membeku.

Suspensi kuman uji yang telah murni diperoleh dengan menginokulasikan 5 koloni kuman kedalam tabung yang berisi 5 ml perbenihan cair yang mempunyai formula sama dengan formula lempeng agar. Perbenihan diinkubasikan 16-24 jam pada suhu 37°C kemudian biakkan ini diencerkan sehingga diperoleh biakkan yang mengandung kuman 10⁵ - 10⁶ per ml. Biasanya untuk kuman coccus gram positif diperlukan penipisan 1:1000 dan untuk batang gram negatif 1:100.000. Lempeng agar dibagi-bagi menjadi beberapa segmen. Teteskan 0.01 ml biakkan diatas pada satu segmen blood agar selanjutnya di inkubasikan selama 18-24 jam.

Pembacaan hasil adalah konsentrasi terkecil obat yang dapat menghambat pertumbuhan kuman. Pertumbuhan yang samar-samar atau tumbuh hanya satu koloni dapat diabaikan tapi bila terdapat beberapa koloni pada beberapa penipisan harus dilakukan pengujian kemurnian kuman. Pada uji ini disarankan memakan kuman kontrol.

c. Cara Pengenceran Tabung

Cara pengenceran tabung untuk menentukan secara kuantitatif konsentrasi terkecil suatu obat yang dapat menghambat pertumbuhan kuman (sama dengan cara penipisan lempeng agar). Prinsipnya adalah penghambatan pertumbuhan kuman dalam perbenihan cair oleh suatu obat yang dicampurkan dalam perbenihan tersebut. Perbenihan yang dipakai merupkan perbenihan yang dapat menumbuhkan secara opimum dan tidak menetralisirkan obat yang dipergunakan. Perbenihan yang sering dilakukan adalah Trypticase Soy atau Tryptic Soy. Untuk kuman anaerob perbenihan yang cocok adalah Thioglycholat. Kadang-kadang untuk pertumbuhan kuman yang fastidious (manja) perlu ditambahkan serum atau asites sebanyak 3%-5% kedalam perbenihan.

Tes dilakukan dengan mempergunakan 1 deretean tabung dengan penipisan-penipisan antibiotika yang dikehendaki. Misalnya larutan Stock antibiotika yang tersedia 100µg/ml. Secara aseptik masukkanlah 0.5 ml media perbenihan cair yang akan dipergunakan ke dalam tipa tabung kecuali tabung 1. Kedalam tabung 1 dan 2 tambahkan 0.5ml larutan stock antibiotika yang akan diperiksa. Campurkan secara merata dan pindahkan 0.5 ml dari tabung 2 ke tabung 3. kerjakan penipisan dengan cara yang sama pada tabung berikutnya sampai tabung 11. Tambahkan 1.5 ml biakkan kuman yang akan diperiksa yang telah diencerkan 1:1000 dari biakkan yang telah dieramkan selama 18-24 jam pada tabung 1 sampai tabung 12, kecuali tabung 11. tabung 12 sebagai kontrol biakan dan tabung 1 sebagai kontrol antibiotika. Konsentrasi akhir obat pada tabung 1=25 µg/ml, tabung 2=12.5µg/ml, tabung 3=6.25 µg/ml dan seterusnya.

Pembacaan hasil:

MIC disini adalah pengenceran tertinggi dari obat yang tidak menunjukkan adanya pertumbuhan kuman secara mikroskopis. Tabung 11 akan tampak jernih, sedang tabung 12 harus tampak keruh. Jika stock antibiotika 100µg/ml dan ternyata tabung 3 tidak menunjukkan adanya pertumbuhan, sedang tabung 4 menjadi keruh maka MIC adalah sebesar 6.25 µg/ml.

Hal yang perlu diperhatikan adalah apabila perbenihan yang dipakai tampak keruh karena penggunaan semu, asites dan lain sebagainya maka pembacaan hasil harus dibandingkan dengan perbenihan tanpa kuman. Agar antibiotika tidak rusak oleh suhu selama pengeraman maka pembacaan harus dilakukan tidak lebih dari 24 jam walaupun pertumbuhan kuman lambat. Karenanya kestabilan obat atau antibiotika yang diperiksa terhadap kuman tertentu harus dipertahankan.

III

CENDAWAN

Cendawan atau fungi mencakup kapang, khamir, dan jamur. Pada umumhya khamir merupakan sel tunggal sedangkan jamur dan kapang bersel ganda.

Tubuh jamur pada dasarnya terdiri dari dua bagian yaitu miselium dan spora. Jamur tersusun dari benang-benang sel panjang yang dihubungkan bersama dari ujung ke ujung. Benang-benang itu disebut hifa. Hifa ini dapat bercabang dan mungkin juga memiliki dinding penyekat yang disebut dengan septa. Dalam beberapa kelas fungi benang-benang ini tidak memiliki septa jadi kelihatan sebagai satu sel panjang yang mengandung banyak inti. Hifa semacam ini disebut dengan Hifa senosit. Dalam pertumbuhan jamur, Hifa ini saling membelit untuk membentuk massa benang yang disebut dengan Miselium. Miselium yang berbulu inilah yang memungkinkan jamur dikenal dengan mudah. Berbagai pigmen dapat teramati pada jamur setelah spora-spora terbentuk.

Faktor yang mempengaruhi Pertumbuhan Jamur.

Umumnya jamur tumbuh baik pada sekitar suhu kamar yang normal (20-30°C) meskipun beberapa jamur ada yang tumbuh baik pada temperatur tinggi (45-50°C) seperti pada Aspergillus fumigatus (Marie Gilstrap et al, 1982). Banyak juga yang tumbuh pada suhu lemari pendingin dan dengan demikian dapat menyebabkan kerusakan pada daging dan sayur mayu dalam penyimpanan dingin. Pada umumnya lingkungan yang hangat dan lembab akan mempercepat pertumbuhan jamur. Berbeda dengan bakteri, Cendawan tidak dapat menggunakan senyawa karbon anorganik seperti misalnya karbondioksida. Karbon harus berasal dari sumber organik, misalnya glukose. Beberapa spesies dapat memanfaatkan senyawa nitrogen, misalnya garam-garam amonium. Tetapi semua cendawan dapat menggunakan nitrogen, itulah sebabnya mengapa medium biakan untuk cendawan biasanya berisikan pepton, suatu produk protein yang terhidrolisis. Jamur memerlukan kelembaban tinggi, persediaan bahan organik (seperti lingkungan yang banyak mengandung gula) dan persediaan oksigen untuk pertumbuhannya.

Pembiakkan:

Untuk mendapatkan koloni yang terpisah dapat dilakukan dengan teknik penggoresan Agar lempengan. Teknik ini lebih menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, akan tetapi memerlukan ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah.

Suspensi dari sampel yang diduga mengandung cendawan (seperti kerokan kulit, sputum, organ/jaringan, cairan spinal, dll) dapat dilakukan penggoresan pada lempengan agar (seperti pada teknik biakkan murni dalam identifikasi bakteri). Media yang dapat dipergunakan untuk pertumbuhan jamur ini adalah Sabouraud’s Glukosa agar atau Potatoes Dekstrosa agar. Suspensi yang telah dibiakkan (digoreskan) pada media tersebut, selanjutnya dieramkan pada suhu kamar selama 24-48 jam.

Sifat biakkan dari cendawan tergantung dari penampilannya pada berbagai media. Koloni yang tumbuh pada media padat diperhatikan (diamati) warna koloni, pinggiran koloni, sifat permukaan, diameter koloni dan bentuknya (tekstur).

Metode Pewarnaan Lactophenol Cotton Blue.

Untuk melihat struktur jamur secara mikroskopis dapat dibuat pewarnaan langsung dengan Lactophenol Cotton Blue.

Cara mengerjakan:

1. Pada sebuah objek gelas yang bersih, taruhlah setetes Lactophenol Cotton Blue. Zat ini akan menambah kontras sehingga jamur akan terlihat lebih jelas.
2. Ambilah media Sabaroud’s agar atau Potatoes Dextrosa Agar yang sudah berisi biakan jamur. Ambilah dua atau lebih koloni yang tampak berbeda.
3. Dengan menggunakan jarum yang tajam ambilah sedikit koloni dan taruh dalam objek gelas yang sudah berisi Lactophenol Cotton Blue. Bagian koloni yang diambil adalah bagian tepi koloni yang sudah berwarna hitam.
4. Selanjutnya objek gelas ditutup dengan copper glass dan diberi vaselin disekelilingnya.
5. Ulangi prosedur diatas untuk koloni yang lainnya.
6. Amati preparat dibawah mikroskop dengan pembesaran 10x atau 45x.

Dapat pula dilakukan pemeriksaan atau mengidentifikasi agen secara langsung dibawah mikroskop menurut (Stephen, B.H., et al, 1980). Untuk hal ini dapat dilakukan terhadap spesimen seperti nodul, jaringan, pangkal rambut atau kerokan kulit.

Cara Pengerjaan:

1. Pada sebuah objek glass yang bersih letakkan sedikit spesimen yang dicurigai terinfeksi jamur.
2. Teteskan 1-2 tetes Potassium Hydroxide (KOH) 10% diatas spesimen tadi.
3. Sediaan tersebut kemudian dipanaskan pelan-pelan (tanpa mendidih), fungsinya untuk menjernihkan jaringan.
4. Sediaan kemudian ditutup dengan gelas penutup dan diperiksa dibawah mikroskop dengan pembesaran kuat.

Penentuan genus dapat dilakukan berdasarkan penampilan koloni pada lempengan agar dan pemeriksaan mikroskopis. Beberapa contoh cendawan yang sering diketemukan dapat dilihat seperti pada gambar lu cari ndiri daaaaahhhhhh.

ABISSSSS